产品简介

Annexin V-Alexa Fluor 647/7-AAD凋亡检测试剂盒，以荧光染料Alexa Fluor 647/7-AAD标记的Annexin V作为探针，检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

检测原理：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料，同PI有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将Annexin V-Alexa Fluor 647与7-AAD联合使用时，7-AAD则被排除在活细胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V-Alexa Fluor 647和7-AAD结合染色呈现双阳性（Annexin V+/7-AAD+）。

产品规格

组分信息

储存条件

2~8℃储存，勿冰冻。Annexin V-Alexa Fluor 647、7-AAD需避光存储。有效期1年。

注意事项

1. 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2. 贴壁细胞的消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免机械损伤。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。尽量不用含EDTA的胰酶消化液，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
3. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。血小板含有PS，可与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并以200 g离心洗去血小板。
4. 试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体集中至管底，避免开盖时液体洒落引起损失。
5. Annexin V-Alexa Fluor 647和PI是光敏物质，操作时请注意避光。
6. 7-AAD为潜在致癌物，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
7. 本产品仅用于科研。

使用说明

一、样品染色

1. 悬浮细胞：300 g，4℃离心5 min收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4 ℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
2. 配制1×Binding Buffer：用去离子水4倍稀释4×Binding Buffer（4 mL 结合缓冲液+12 mL 去离子水）。
3. 用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300 g，4 ℃离心5 min。
4. 加入1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1-5×10⁶细胞/mL。
5. 取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647，轻轻混匀后于室温避光孵育5min。
6. 加入10 μL 7-AAD（20 µg/mL）。
7. 加入400 μL PBS Buffer，混匀，样品在1小时内检测。

【注意】为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

二、观察检测

1. 流式细胞仪

用流式细胞仪检测，Annexin V-Alexa Fluor 647的激发波长Ex=651nm，发射波长Em=672 nm；7-AAD的激发波长Ex=546 nm；发射波长Em=647 nm。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），Alexa Fluor 647为横坐标，7-AAD为纵坐标。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

1. 荧光显微镜

1. 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。
2. 用PBS洗涤细胞两次。
3. 在500 μL的Binding Buffer 中加入1 μL Annexin V-Alexa Fluor 647，5 μL 7-AAD染液混匀。
4. 将上述溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖。
5. 室温避光孵育5 min。
6. 将盖玻片倒置于载玻片上，在荧光显微镜下用双色滤光片观察。